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產(chǎn)品說明：

使用說明：

建議工作濃度

1）大腸桿菌篩選：25-50μg/mL（低鹽LB培養(yǎng)基，NaCl濃度不能超過5g/L）

2）酵母菌篩選：50-300μg/mL（YPD或基本培養(yǎng)基）

3）哺乳動物細(xì)胞篩選：50-1000μg/mL（合適培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞系而不同）

操作步驟

一、建立殺滅曲線

1. 重新鋪板或者將滿盤細(xì)胞重新分盤，使得細(xì)胞密度約25%，按照8個(gè)平板/組準(zhǔn)備，培養(yǎng)24 h。

2. 去除舊培養(yǎng)基。加入含不同濃度博來霉素的篩選用培養(yǎng)基，博來霉素濃度可設(shè)置為0，50，100，200，400，600，800和1000 μg/mL，每個(gè)濃度做3個(gè)平行；也可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)體系，設(shè)置不同的濃度梯度。

3. 每3-4天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，并觀察存活細(xì)胞的比例。選擇在合適的時(shí)間（1-2周內(nèi)）殺死大多數(shù)細(xì)胞的濃度為最佳工作濃度。

【注】：若是難以在顯微觀察下區(qū)分活細(xì)胞，也可用臺盼藍(lán)染色來計(jì)算存活細(xì)胞的數(shù)量，以確定博來霉素的最適濃度。

二、篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞

1. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用100 mm培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對照。

2. 轉(zhuǎn)染后，用預(yù)熱的1× PBS洗滌一次，加入新鮮培養(yǎng)基。
3. 轉(zhuǎn)染48-72 h后，用含有最佳濃度博來霉素（由滅殺曲線確定）的新鮮培養(yǎng)基篩選細(xì)胞。為了更好的鑒定和篩選細(xì)胞集落，建議將細(xì)胞按比例稀釋成一系列濃度。
【注】：若待篩選細(xì)胞對博來霉素的抗性明顯強(qiáng)于大部分細(xì)胞，或者細(xì)胞快速分裂導(dǎo)致低濃度情況博來霉素的篩選效果不明顯，按照以下方法克服此類耐性：

a）將細(xì)胞直接用含博來霉素的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行分盤；

b）37℃孵育2-3 h直至細(xì)胞貼壁；

c）從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞并于4℃放置2 h，一定要確保培養(yǎng)基內(nèi)含有HEPES。【此步的目的在于短時(shí)間內(nèi)終止細(xì)胞分裂活動，從而允許博來霉素抗性得以發(fā)揮，殺死細(xì)胞。】

d）細(xì)胞重新放回37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

4. 每3-4天加入選擇培養(yǎng)基，直到出現(xiàn)細(xì)胞集落。

5. 挑選并轉(zhuǎn)移克隆到96或48孔板中。在進(jìn)行更大孔徑培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上擴(kuò)大培養(yǎng)之前，確保培養(yǎng)細(xì)胞密度近100%。

三、維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞

可采取以下方式維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞：

a）使用含相同劑量博來霉素的篩選培養(yǎng)基來維持培養(yǎng)；

b)  降低博來霉素劑量為原來的一半進(jìn)行維持培養(yǎng)；

c）使用正好能預(yù)防敏感細(xì)胞生長但不足以致死的博來霉素劑量來維持培養(yǎng)【參考?xì)缜€】。

注意事項(xiàng)：

1）Zeocin?對光敏感，需將抗生素，或含該抗生素的平板或培養(yǎng)基置于黑暗處。

2）降低培養(yǎng)基的鹽濃度，調(diào)整pH到7.5使其保持活性，因高離子強(qiáng)度和酸或堿性都會抑制Zeocin?活性。

3）儲存Zeocin?在-30°C~-10°C，使用前需冰上融化。

4）Zeocin?有毒，操作時(shí)需注意防護(hù)，切勿與身體或皮膚直接接觸。

5）為了您的健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。